L'area dove oggi sorge Isernia è stata abitata dall'uomo sin dall'era paleolitica: i primi insediamenti, infatti, risalgono ad almeno 700.000 anni fa. Anche le origini dell'agglomerato urbano sono molto antiche, ma non se ne può ancora definire una data certa.
La città fu sotto il dominio Sannita fin dal V secolo a.C. Grazie alla sua posizione strategica, il suo controllo fu uno dei punti cruciali durante le guerre sannitiche. Nel 264 a.C. divenne colonia romana e nel 209 a.C. rimase fedele a Roma nella seconda guerra punica. Nel periodo che va dal 263 a.C. al 240 a.C., cioè dopo la deduzione a colonia, furono coniate le monete di Aesernia. Alcuni autori ritengono che parte della monetazione della guerra sociale possa essere stata coniata nello stesso centro. Durante la guerra sociale, nel 90 a.C. fu occupata dagli italici dopo un lungo assedio e divenne la loro capitale. Cadde alla fine della guerra per mano di Silla, il quale la rase al suolo.
Negli anni successivi, vari imperatori, da Cesare a Nerone, promossero un piano di ripopolamento inviando colonie nei territori ove sorgeva la città. Ai tempi di Traiano, Isernia venne elevata al rango di Municipio; in quel periodo, venne anche costruito il Capitolium.
Dopo la caduta dell'Impero romano, Isernia venne distrutta nel 456 dai Vandali, capitanati da Genserico, per ben tre volte dai Saraceni, negli anni 860, 882 e 883.
Nel VII secolo, i Longobardi ne promossero la rinascita con la costruzione di opere pubbliche. Successivamente, durante il dominio normanno, nel quale faceva parte della contea di Molise, subì una fase di decrescita: la sua diocesi fu unificata con quelle di Venafro e Bojano. Inoltre, nel 1199, fu saccheggiata da Marcovaldo di Annweiler. Nel XIII secolo, la città rinacque ancora, grazie a Federico II.