Le tracce rinvenute assieme a resti di una necropoli neolitica, trovati in località Toppo d'Aguzzo a Rapolla nelle vicinanze del territorio venosino, certificano la presenza umana nel territorio di Venosa sin dai tempi della Preistoria. Gran parte di queste testimonianze si trovano al "Parco Paleolitico" di Notarchirico, un'area non molto lontana dal centro. La cittadina, probabilmente fondata dalle popolazioni latine, fu strappata dai Romani ai Sanniti nel 291 a.C. dal console Lucio Postumio Megello, che ne fece una colonia latina, ove si trasferirono circa 20.000 individui. Dopo la battaglia di Canne (216 a.C.) vi riparò il console sconfitto Gaio Terenzio Varrone. Durante la seconda guerra punica, nel 208, vi morì il console Marco Claudio Marcello, attaccato da Annibale durante una ricognizione. In seguito alla guerra annibalica la città fu ridedotta (200 a.C. ca.), con l'invio di nuovi coloni. Nel 190 a.C. la fondazione della Via Appia è occasione di forte sviluppo del centro. Durante la guerra sociale fu al fianco degli alleati italici, ma fu sottomessa da Quinto Cecilio Metello Pio e nell'89 a.C., nonostante questo, ricevette il titolo di Municipium (città romana), ottenendo il diritto di voto e di cittadinanza per i suoi abitanti. Con l'apporto di nuovi coloni, Venosa acquisì un grande sviluppo, data anche la sua collocazione privilegiata nella Via Appia (una delle più importanti vie di comunicazione dell'antichità), che collegava Roma a Brindisi. Nel 65 a.C., nel municipio nacque e visse la propria adolescenza Quinto Orazio Flacco, uno dei più illustri poeti dell'epoca antica, emigrato, in seguito, a Roma. Nel 43 a.C. fu oggetto di una nuova deduzione da parte dei triumviri, che ne espropriarono i terreni dell'ager publicus, ridistribuendoli tra i veterani.
Con l'età imperiale, nei primi periodi dell'avvento del Cristianesimo (intorno al 70 d.C.), si insediò a Venosa una delle prime comunità ebraiche in Italia, che riuscì a integrarsi con la popolazione locale. Una testimonianza di tale convivenza è la collina della Maddalena, in cui sono collocate nelle sue cavità sia sepolture semite che cristiane. Nel 114 d.C. fu aperta la via Traiana, che collegava Benevento e Brindisi ma che non toccò Venosa, portando conseguenze economiche svantaggiose per la città. Diverse le ipotesi sull'etimologia di Venusia. Raccoglie maggior credito quella che ritiene la città fondata in onore della dea dell'amore, Venere (in latino Venus, anche tramite il trasformato fenicio Benoth). Per altri, l'origine del nome è nell'abbondanza e bontà dei suoi vini (vinosa), oppure nelle vene d'acqua di cui è ricca o, ancora, nel clima ventilato (ventosa).
Con la caduta dell'impero romano e il conseguente avvento dell'era medievale, Venosa fu soggetta a ripetute occupazioni da parte di popolazioni barbariche dal V secolo. Nel 476 gli Eruli di Odoacre invasero la cittadina mentre gli Ostrogoti, nel 493, la trasformarono in un centro amministrativo, politico ed economico, titolo in seguito conferito ad Acerenza. Tra il 570 e il 590, i Longobardi la elessero sede di gastaldato; nell'842 la città fu saccheggiata dai Saraceni, i quali, a loro volta, furono cacciati da Ludovico II, imperatore del Sacro Romano Impero. Seguirono i Bizantini, che furono sconfitti, durante la battaglia del fiume Olivento, dai Normanni di Arduino nel 1041. Durante il dominio normanno, Venosa fu assegnata a Drogone d'Altavilla. Da segnalare anche la presenza dei Greci intorno al 980 d.C., testimoniata dal monastero di "San Nicola di Morbano". Nel 1133, Venosa fu saccheggiata e data alle fiamme da Ruggero II di Sicilia. Con la venuta degli Svevi, Federico II fece costruire un Castello, eretto in un luogo ove esisteva un fortilizio Longobardo dell'XI secolo, a cui assegnerà la funzione di Tesoro del Regno (Ministero delle Finanze). Dal 1200, il Castello divenne il convento dei Frati Agostiniani, passato poi ai Salesiani e infine ai Padri Trinitari, che ancora oggi albergano nell'edificio. Intorno al 1177, circa lo stesso periodo dei Frati Agostiniani, vi era la presenza di monache nel "Monastero di San Benedetto". Nel 1232, nasce a Venosa il futuro imperatore svevo Manfredi, figlio di Federico II e Bianca Lancia. Agli Svevi successero gli Angioini e nel 1304, l'imperatore Carlo D'Angiò assegna Venosa con titolo comitale al figlio Roberto, detto "Il Saggio".